Из чего формируется веретено деления. митоз - аппарат клеточного деления. Сборка с участием центросом

/. Строение веретена

2. Функции веретена. Механизмы движений нитей

1. При делении ядра между двумя противоположными полюсами клетки образуется так называемое веретено, состоящее :

Из нитей (волокон), которые представляют собой пучки из большого числа микротрубочек (иногда более 100);

Двух центриолей, каждая из которых находится на своем полю­се с различными центрами-организаторами:

Либо с перицентриолярным центром-организатором микро­трубочек (у животных);

Либо с аморфным ("полярная шапочка" у большинства рас­тений);

Либо с пластинчатым или слоистым ("веретенные полярные тельца" у многих грибов и некоторых подорослей).

Дополнительный центр-организатор - кинетохор - лежит у центромеры каждой хроматиды. Различают следующие виды нитей веретена :

Хромосомные (кинетохорные, или тянущие) нити, которые об­разуются из кинетохора и связывают его с одним из полюсов;

Центральные нити, образующиеся из полярных центров-ор­ганизаторов и связывающие между собой оба полюса;

Полярные нити, которые образуются только при наличии цен­триолей в перицентриолярных центрах-организаторах и окан­чиваются в цитоплазме.

2. Функции веретена деления состоят в следующем :

Веретено обеспечивает расхождение хроматид или хромосом к полюсам. Хромосомные нити укорачиваются и тянут хромосо­мы в сторону полюсов;

У животных центральные нити обычно удлиняются и отодви­гают полюса друг от друга. Толщина нитей веретена при этом не изменяется.

Механизмы движений нитей :

Активное скольжение нитей веретена происходит, видимо, при взаимодействии с динеиноподобным белком. Механизм схож с механизмом движения жгутиков;

Активную роль играют микрофиламенты, которые прикрепля­ются к нитям веретена и подтягивают с их помощью хромати-ды или хромосомы. В аппарате веретена найдены актиновые нити и миозин. Цитоханазин, дестабилизирующий актиновые нити, способен блокировать действие веретена.

Микротрубочки - полые структуры, состоящие из тубулина, имеются, по существу, во всех эукариотических клетках. Обычно они «растут» из центриолей или других менее заметных центров-организаторов, исчезают и вновь появляются на определенных стадиях развития клетки. Для прокариот характерно отсутствие тубулиновых микротрубочек.

Диаметр микротрубочек 24 нм; они образованы спирально уложенными субъединицами, состоящими из димеров тубулина, 13 субъединиц на виток. Микротрубочки из всех изученных источников в химическом отношении удивительно сходны: они состоят из двух близко родственных белков, α и β-тубулина, каждый из которых имеет мол. массу 55000-60000. Эти два тубулина часто обнаруживаются в комплексе с динеином, Mg 2+ — чувствительной АТРазой. Тубулины нередко бывают ассоциированы также с другими, хуже охарактеризованными высокомолекулярными белками, так называемыми БАМ (белки, ассоциированные с микротрубочками). Существует поразительная физиологическая гомология между системами микротрубочек у организмов, принадлежащих к весьма отдаленным таксонам. Микротрубочки обычно чувствительны к изменениям температуры и давления. Так, при высоком гидростатическом давлении они имеют тенденцию растворяться, а при восстановлении нормального давления могут образовываться снова. Как правило, микротрубочки наиболее стабильны при 37°С и растворяются примерно при 4°С. Они чувствительны к концентрации ионов кальция и к некоторым химическим соединениям, таким как алкалоид колхицин. Не все эти свойства наблюдаются у всех микротрубочек, но в результате интенсивного исследования обнаружено много гомологий.

Микротрубочки и образуемые ими структуры чувствительны к следующим циклическим соединениям, каждое из которых содержит по меньшей мере один метоксизамещенный атом углерода: к колхицину, колцемиду, винбластину, винкристину, гризеофульвину, мелатонину, мейтанзину, подофиллотоксину и многим их производным. Эти препараты, так же как некоторые карбаматы, нокодазол и другие вещества, ингибируют полимеризацию белка микротрубочек. Показано, что колхицин и транквилизатор хлорпромазин непосредственно присоединяются к тубулину. Чувствительность систем микротрубочек к физическим факторам и химическим препаратам сильно варьирует в зависимости от концентрации последних, вида организма, стадии его развития и многих других факторов, но, как правило, эти агенты вызывают растворение митотического веретена и прекращают движение хромосом, не действуя на сами хромосомы. Упомянутые выше вещества даже в очень малых концентрациях могут влиять и на другие клеточные функции, связанные с микротрубочками (например, на питание и поддержание структурной асимметрии у солнечников). Бактерии размножаются прямым делением; в нем не участвуют микротрубочки, и оно не чувствительно к действующим на них агентам. Как полагают, ДНК у прокариот распределяется между дочерними клетками благодаря тому, что она прикреплена к растущей мембране. У делящихся бактерий никогда не наблюдались ни центриоли, ни митотическое веретено, ни микротрубочки, ни какие-либо формы центров, организующих микротрубочки.

Первоначальное использование микротрубочек в ундулиподиях и их последующая эволюция в составе митотического аппарата преадаптировали их для выполнения многих функций у протоктистов, животных, растений и грибов. Чувствительность полимеризации тубулина к ингибиторам была использована для выяснения роли микротрубочек в жизни эукариотической клетки. Микротрубочки, чувствительные к колхицину, образуются у протестов, когда они вытягивают аксоподии для захвата пищи. Микротрубочки фактически образуют «весла», которыми гребут похожие на галеры радиолярии Sticholonche; они участвуют в регенерации полиплоидного ядра у ресничных инфузорий и в формировании «зубастой» глоточной корзинки у Nassula-инфузории, которая «пережевывает» нитчатые цианобактерии. Микротрубочки поддерживают «ножки» инфузорий, ползающих по листьям растений; ряды микротрубочек образуют щупальца хищных сосущих инфузорий. «Рты» других протоктистов, такие как мембранеллы разноресничных инфузорий, состоят из пучков ундулиподий.

У животных микротрубочки являются важными компонентами нервной системы: они образуют дендриты и аксоны нейронов и принимают участие в аксонном транспорте. Один из самых удивительных примеров использования модифицированных ресничек, состоящих из микротрубочек - это сенсорные клетки млекопитающих. Вкусовые и обонятельные рецепторы, органы равновесия, механорецепторы насекомых-все они содержат видоизмененные ундулиподии с микротрубочками. Изучение анатомии и функционирования этих сенсорных систем привело к микротубулярной теории преобразования стимулов (Дж. Атема). Согласно этой теории, различные сенсорные стимулы вызывают конформационные изменения в белке микротрубочек, которые передаются от начала последних (на периферии сенсорной клетки) к их основанию и трансформируются в нервные импульсы.

Неспособность тубулина полимеризоваться с образованием микротрубочек, связанная с недостатком гормона щитовидной железы, который на ранних стадиях развития стимулирует эту полимеризацию, может лежать в основе явлений кретинизма (J. Nunez, личное сообщение). Микротрубочки составляют часть внутриклеточной транспортной системы как у позвоночных, так и у беспозвоночных. У симбиотической гидры микротрубочки участвуют в транспорте поглощенных водорослей от проксимальной (обращенной в гастроваскулярную полость) стороны пищеварительных клеток к их дистальной стороне; это обеспечивает наилучший доступ света к новым хлореллам-симбионтам. У грибов микротрубочки, вероятно, принимают участие в миграции ядер-процессе, поддерживающем дикариотическое состояние. У бобовых гербицид трифлюралин, ингибитор образования микротрубочек, сильно замедляет формирование азотфиксирующей симбиотической ассоциации, влияя на морфогенез растительных клеток, в котором участвуют микротрубочки.

В общем микротрубочки и их активность необходимы для выполнения по крайней мере следующих основных функций: движения хромосом при митозе, формирования асимметричной клеточной структуры, внутриклеточного транспорта, движения ундулиподий и внутриклеточной передачи информации. Они играют важнейшую роль в жизни эукариотической клетки.

Генетическое поведение микротрубочек, изученное главным образом на инфузориях, загадочно. Большинство инфузорий имеет толстый поверхностный кортекс, который состоит из видоспецифических стабильных структур, образованных микротрубочками, мембранами и филаментами. Эти структуры кортекса толщиной от одного до нескольких микрометров настолько сложны и специфичны, что можно проводить генетические эксперименты по скрещиванию стабильных кортикальных вариантов. В литературе по кортикальной генетике инфузорий накопилось немало неожиданных фактов. Твердо установлена независимость кортикальной наследственности от ядерной. Особенно интересны работы, проведенные на Paramecium aurelia. При конъюгации, спаривании инфузорий, когда происходит обмен ядрами без слияния цитоплазмы, идентичные ядра могут попадать в разное цитоплазматическое окружение.

Некоторые кортикальные признаки перелаются только тем родителем, от которого наследуется цитоплазма. Генетические детерминанты кортикальной наследственности инфузорий находятся не в цитозоле и не в митохондриях, а в самом кортексе. У одной и той же клетки и, видимо, под контролем одного и того же ядра могут быть ундулиподии двух типов: 9 + 0 и 9 + - 2. У экспериментально энуклеированных гипермастигот происходит рост групп ундулиподиальных поясов, число ундулиподий увеличивается и в процессе гаметогенеза образуются митотические веретена. Микротубулярные структуры можно разрушить облучением или химическими агентами, действующими на нуклеиновые кислоты, и они никогда не восстанавливаются при участии одних только ядерных генов. Эти факты подкрепляют представление о генетической автономии системы ундулиподии - митотический аппарат.

Известно, что реплицирующиеся структуры всегда содержат нуклеиновую кислоту; репродукция центров, организующих микротрубочки ундулиподий и других компонентов микротубулярной системы, вероятно, тоже контролируется нуклеиновой кислотой, даже если не находится под прямым ядерным контролем. Центры - организаторы микротрубочек, судя по их виду и окрашиваемости, состоят из белка; возможно, что в них есть и нуклеиновые кислоты.

Центриоли и кинетосомы образуются либо из предсуществующих структур типа 9 + 0, либо из центров-организаторов с менее определенным строением. Хотя первоначально было описано «деление» кинетосом, теперь установлено, что они не претерпевают деления как такового. Они являются продуктами сложного процесса, детали которого варьируют в зависимости от вида организма и стадии жизненного цикла. Центриоли могут формироваться из мелких аморфных предшественников, которые развиваются в процентриоли , большей частью непосредственно связанные с предсуществующими зрелыми кинетосомами или центриолями. На одну исходную кинетосому может приходиться от 1 до 250 и более совместно созревающих процентриолей или прокинетосом; их бывает много в так называемых блефаропластах в сперматоцитах растений. В электронном микроскопе процентриоли до того, как они приобретают типичную девятилучевую симметрию, выглядят как гранулярно-фибриллярные образования; их можно рассматривать как центры-организаторы микротрубочек. У самих процентриолей может вовсе не быть морфологически различимых микротубулярных предшественников. Таким образом, отсутствие центриолей отнюдь не означает отсутствия генетического потенциала для их построения. Некоторые жгутиковые амебы, такие как Naegleria и Tetramitus, не имеют на амебоидных стадиях каких бы то ни было кинетосом, но сохраняют генетический потенциал для формирования кинетосом, ундулиподий и других родственных структур. Если популяцию клеток Naegleria встряхивать в среде, не содержащей питательных веществ, например в дистиллированной воде, то происходит быстрое формирование кинетосом, из которых развиваются ундулиподии. Таким образом, у некоторых организмов генетические детерминанты ундулиподий могут дедифференцироваться до элементов, неразличимых в электронном микроскопе.

У большинства животных и растений у каждой хромосомы имеется дифференцированный участок - кинетохор (центромера, место прикрепления нитей веретена). Только интенсивное исследование подходящих объектов, таких как некоторые протисты из кишечника термитов, изученные Кливлэндом, позволило понять взаимоотношения между кинетохором и остальной частью митотического веретена. Кливлэнд пришел к выводу, что в плане онтогенеза и филогенеза кинетохоры составляют часть митотического аппарата и системы ундулиподий, а не часть хромосомной системы, в которую они обычно включены. Он показал, что у симбионтов термитов под действием кислорода происходит селективное разрушение хроматина, но на пучках микротрубочек тем не менее образуются кинетохоры.

В клетках, обработанных кислородом, кинетохоры «растаскивались» веретеном даже при отсутствии хромосом, к которым они прикрепляются в нормальных клетках. Таким образом, Кливлэнду удалось отделить рост веретена, деление кинетохоров и само деление клетки от репликации хромосом. Он также показал, что хроматин не принимает прямого участия в контроле функций веретена: скорее «число митотических веретен всегда зависит от числа центриолей, и часто, когда в этих мультицентриолярных клетках хромосомы имеют возможность выбора, они движутся вдоль периферических, а не центральных веретен».

Поскольку под центриолью Кливлэнд понимал ростральный участок, функционирующий как митотический центр, а не истинную центриоль типа 9 + 0, его точка зрения была уязвима для критики. Суть его утверждения состояла в том, что только растущие нити веретена (как теперь известно, это микротрубочки, растущие от структур, прикрепленных к пучкам ундулиподий) определяют расхождение хромосом в дочерние клетки. Сам хроматин, хотя он и может скручиваться и раскручиваться, конденсироваться и разрыхляться, не способен к внутриклеточному движению; хромосомы, таким образом, не ответственны за свой собственный переход в дочерние клетки. Передвижение хромосом у растений, животных, грибов и многих протистов всецело осуществляют структуры, связанные с ундулиподиальной системой. Так, например, Кливлэнд писал:

«…Кислород в концентрации 70-80% разрушает все хромосомы жгутиконосца-гипермастиготы Trichonympha, если обработка производится на ранних стадиях гаметогенеза, когда хромосомы находятся в процессе удвоения. При такой обработке утрата хромосом не ведет к повреждению цитоплазмы и ее органелл. В результате функционирования центриолей образуются ахроматическая фигура [веретено и другие части митотического аппарата], жгутики [ундулиподии] и парабазальные тельца [тельца Гольджи]. Затем цитоплазма делится с образованием двух безъядерных гамет, которые проходят некоторые стадии цитоплазматической дифференцировки, характерной для мужских и женских гамет Trichonympha».

С другой стороны, наблюдения Кливлэнда над двуядерной клеткой, содержавшей пять центриолей, показали, что «…без центриолей не образуется ахроматической фигуры [веретена] и не происходит движения хромосом к полюсам, приводящего к формированию дочерних ядер. Хромосомы репродуцируются, а ядра - нет. Для репродукции ядра нужно, чтобы в клетке было не меньше двух центриолей и они находились достаточно близко к ядру».

Таким образом, Кливлэнду была ясна ведущая роль веретена и системы ундулиподий в сегрегации хроматина, но, к сожалению, он редко сообщал о своих открытиях современникам в четкой форме.

Функция кинетохоров состоит в прикреплении хромосом к митотическому веретену. Многие цитогенетические исследования показали, что хромосомы, лишенные кинетохоров, будучи неспособны прикрепиться к нитям веретена, просто не попадают на полюса делящейся клетки и потому не включаются в дочерние ядра. При движении хромосом к полюсам кинетохоры всегда находятся впереди. У некоторых аномальных хромосом бывает два кинетохора, которые стремятся направиться к противоположным полюсам; такие дицентрические хромосомы обычно разрываются, и каждый фрагмент со своим кинетохором включается в одно из дочерних ядер.

Хотя детали этих процессов чрезвычайно разнообразны, функция центриолей, кинетохоров, а также центров, организующих микротрубочки, и их производных в процессе митоза состоит в распределении хромосом между дочерними клетками. Митотическое веретено может, кроме того, использоваться для распределения митохондрий и пластид. Наличие единственной большой митохондрии может быть причиной удивительного явления, наблюдаемого у трипаносом, например у Trypanoplasma. При каждом клеточном делении здесь образуется второе веретено более или менее обычного вида; структура, из которой оно растет, расположена в основании ундулиподии (эти клетки имеют одну ундулиподию на переднем конце). Деление этой структуры («Blepharoplastteilung») происходит одновременно с делением обычного веретена, участвующего в делении ядра, и столь же хорошо заметно. Таким образом, у этих протистов, по-видимому, формируется второй митотический аппарат, прикрепленный или по крайней мере точно направленный к ундулиподии. Кинетопласт, или блефаропласт, - единственная длинная митохондрия, содержащая большое количество повторяющихся последовательностей ДНК, тоже ориентирована в направлении ундулиподии.

У другой трипаносомы, Leishmania, кинетопласт делится синхронно с каждым делением ядра и остальной клетки. Дж. Кьюзел выделил этот кинетопласт - вероятно, самую большую из известных одиночных митохондрий. В градиенте плотности хлористого цезия была обнаружена сателлитная полоса ДНК, связанной с кинетопластом, что согласуется с сообщениями о включении меченого тимидина в ДНК кинетопласта. Дифференциация этой единственной специализированной митохондрии приходится на ту часть жизненного цикла, в которой происходит окислительное фосфорилирование. Вероятно, второе веретено возникло как механизм, обеспечивающий регулярное распределение материала кинетопласта между дочерними клетками. С помощью акрифлавина можно получить штаммы Leishmania, лишенные кинетопласта; по-видимому, это вещество избирательно ингибирует синтез его ДНК. Клетки, обработанные акрифлавином, вначале проходили несколько делений, при которых ДНК кинетопласта распределялась поровну, но затем происходило деление, при котором одна из дочерних клеток получала всю эту ДНК, а другая не получала ее вовсе (становилась дискинетопластной). Из этих данных Л. Симпсон заключил, что акрифлавин влияет и на синтез кинетопластной ДНК, и на ее распределение между дочерними кинетопластами.

Ни один из известных организмов не имеет структур, промежуточных между ундулиподиями и бактериальными жгутиками. Пропасть между прокариотами, не содержащими центров-организаторов микротрубочек и их продуктов, и эукариотами, которые всегда их имеют, требует эволюционного объяснения. У некоторых эукариот. например у красных водорослей, ундулиподии отсутствуют на всех стадиях жизненного цикла, хотя у них есть оплодотворение и мейоз. Многие биологи предполагали, что среди всех эукариот красные водоросли - наиболее близкие родственники цианобактерий. Согласно этой точке зрения, красные водоросли примитивны в том смысле, что в процессе их эволюции никогда не возникала компартментализация. ведущая к образованию ундулиподий.

Хотя из этих наблюдений был сделан вывод, что красные водоросли произошли от предков, обладавших ундулиподиями, низкое качество электронных микрофотографий не позволяет считать эти данные однозначными. Однако на митотических полюсах в клетках красных водорослей были обнаружены сложные центры-организаторы, состоящие из кольца микротрубочек, и это заставляет думать, что предками Rhodophyta действительно были организмы, передвигавшиеся ранее помощью ундулиподий. Может быть, они пожертвовали жгутиками ради развития полового процесса? Во всяком случае у красных водорослей имеются митохондрии и микротубулярные структуры, гомологичные таковым других эукариот. Их высокоразвитая половая система, безусловно, весьма прогрессивна: это никак не промежуточное звено между делением прокариот, не имеющих микротрубочек, и митозом и мейозом эукариот, обладающих ими. Гat же тогда промежуточное звено? Откуда произошли ундулиподии?

Если бы центриоли, кинетохоры и митотическое веретено образовались как эписомы из ядра, то они, вероятно, были бы более чувствительны к факторам, влияющим на ядро, чем к воздействиям, повреждающим ундулиподии, однако фактически наблюдается как раз обратное. Центриоли, звезды, веретёна, кинетохоры и кинетосомы - все эти органеллы по своему составу, поведению и развитию родственны микротубулярно-ундулиподиальной системе, а не системе хроматина.

Важное различие между митозом и распределением генофора прокариот при делении состоит в количестве ДНК, которое необходимо передать дочерним клеткам. Если бы ДНК прикреплялась к автореплицирующейся внутриклеточной органелле, копии которой были бы способны к сегрегации при клеточном делении, такой механизм обеспечил бы равное распределение больших количеств генетического материала независимо от содержащейся в нем информации. Гипотеза, развиваемая здесь, состоит в том, что прикрепленные к клеткам симбиотические микробы - спирохеты - предоставили свою реплицирующуюся нуклеиновую кислоту для репродукции мест своего прикрепления, и последние эволюционировали затем в кинетосомы, а сами клетки спирохет в ундулиподии. Эта гипотеза при всей ее кажущейся экстравагантности совместима с тем принципом, что эволюция оппортунистична (т. е. пользуется уже имеющимися возможностями), а не телеологична.

Представление о симбиотическом происхождении ундулиподий помогает объяснить ряд необычных фактов, например прямую морфологическую связь между митозом, аксоподиями и ундулиподиями у протестов. Существование тубулиновых микротрубочек, вариации в числе, но не в размерах ундулиподий и отсутствие каких-либо организмов, которые могли бы быть промежуточным звеном между прокариотами и эукариотами в эволюции подвижности и клеточного деления, все это совместимо с гипотезой о симбиотическом происхождении ундулиподий. Согласно этой гипотезе, геном прокариотического организма, ставшего первой ундулиподией, превратился в нуклеопротеид центра-организатора микротрубочек. Если признать гомологию между ундулиподиями и митотическим аппаратом (которую признает большинство биологов) и принять гипотезу о том, что митоз выработался путем прогрессивной дифференциации поверхностных симбионтов (с чем большинство биологов не согласно), то можно построить грубую схему филогении протоктистов. Эта схема основана на представлении о том, что эволюция митоза определила главные пути дифференциации клеточной структуры и жизненных циклов.

Веретено представляет собой комплекс, состоящий из микротрубочек и связанных с ними моторных белков. Организация микротрубочек обладает высоким уровнем поляризации

Микротрубочки веретена представляют собой очень динамичную структуру. Одни проявляют динамическую нестабильность, для других характерна текучесть субъединиц

Сила, необходимая для сборки веретена, генерируется при взаимодействии микротрубочек с моторными белками

Образование и функционирование веретена зависят от динамических свойств микротрубочек и от работы связанных с ними белковых моторов. Хотя микротрубочки образуют основные структурные элементы веретена, их организация и движение хромосом обеспечиваются белковыми моторами. Одни моторы непосредственно участвуют в сборке веретена и в связывании его компонентов в определенную структуру, а другие обеспечивают присоединение хромосом к веретену и генерируют силу, необходимую для их перемещения.

Несмотря на то что традиционно веретено рассматривается как структура, состоящая из микротрубочек , правильнее считать ее комплексом микротрубочек, белковых моторов и других белков.

Хотя моторы играют существенную роль в генерации силы, необходимой для функционирования веретена , микротрубочки представляют собой нечто большее, чем просто неподвижную структуру, вдоль которой они движутся. Во время митоза микротрубочки ведут себя как высокодинамичная структура, и это их свойство играет важную роль при сборке веретена и расхождении хромосом.

В пределах веретена микротрубочки организованы в соответствии с полярностью. Два конца микротрубочки различаются по составу и структуре. Это обусловливает ее структурную «полярность»; микротрубочка как бы указывает то или иное направление. В каждом полуверетене и связанной с ним звезде микротрубочки расположены с одинаковой полярностью: их минус-концы находятся на полюсах, а плюс-концы, на некотором от них расстояниии.

В месте пересечения двух поляризованных пучков микротрубочки перекрываются, создавая область в центре веретена, в которой соседние микротрубочки имеют противоположную полярность. Одинаковая ориентация микротрубочек в каждом полуверетене необходима для нормального функционирования их моторов при делении. Если бы полярность микротрубочек в пределах каждого полуверетена была произвольной, то молекулы каждого типа моторов просто мешали бы друг другу, делая движение хаотичным или просто невозможным.

Динамические свойства микротрубочек играют важную роль во всех фазах . Исследования, проведенные на культуре клеток позвоночных и с использованием экстрактов из яйцеклеток лягушки Xenopus laevis, показали, что в каждом веретене микротрубочки характеризуются динамической нестабильностью и являются более короткими и гораздо более динамичными, чем в интерфазных клетках. Некоторые различия можно объяснить возрастанием частоты катастроф в митозе, когда плюс-концы микротрубочек из состояния роста или полимеризации переходят в состояние укорочения или разрушения. Частично это также объясняется снижением частоты наступления спасений, при которых процесс деполимеризации или укорочения микротрубочек обратно переходит в процесс их полимеризации или роста.

Это усиление динамики происходит в клетках, вступающих в митоз, поскольку белки, связанные с микротрубочками и обычно препятствующие катастрофе, заингибированы, в то время как другие, стимулирующие рост микротрубочек, активируются. Баланс между двумя противоположно направленными процессами поддерживается основной киназой, регулирующей митоз, комплексом циклин B/CDK1, которая активируется во время разрушения ядерной оболочки. Как будет показано ниже, усиление динамики микротрубочек в клетках, вступающих в митоз, играет основную роль в сборке веретена.

После образования веретена начинает проявляться еще один тип динамики микротрубочек. В это время микротрубочки обнаруживают текучесть субъединиц. Это интересное явление заключается в том, что субъединицы тубулина присоединяются к плюс-концу микротрубочки и затем продвигаются по ней к минус-концу, на котором высвобождаются. Как следует из рисунков ниже, текучесть характерна для всех микротрубочек веретена, однако особенно она проявляется у микротрубочек нитей кинетохора. Происхождение этого явления не вполне понятно, но, возможно, оно связано с взаимодействием плюс- и минус-концов микротрубочек веретена с другими его компонентами (например, с белковыми моторами). Даже в то время, когда у микротрубочек веретена наблюдается текучесть, астральные микротрубочки продолжают проявлять динамическую нестабильность.

Хотя значение явления текучести неизвестно, возможно, оно играет роль в перемещении хромосом и в поддержании баланса сил в веретене, с тем чтобы две его половины оставались расположенными симметрично.

С системой микротрубочек взаимодействуют много различных типов белковых моторов . В митозе участвует цитоплазматический мотор динеин, осуществляющий транспорт к минус-концу, и моторы группы кинезинов (большая часть которых движется в направлении плюс-конца). Веретено имеет сложную организацию, и моторы настолько тесно связаны с его формированием и функцией, что только в делении клеток высших организмов участвует более 15 представителей семейства кинезинов.

Белковые моторы расположены по всему веретену. Они находятся на кинетохорах, на плече хромосом, на полюсах и на микротрубочках между полюсами и хромосомами. Многие типы моторов располагаются только в определенных местах, другие занимают несколько мест. Например, цитоплазматический динеин обнаружен в кинетохорах и на полюсах, а также в клеточном кортексе, где он взаимодействует с астральными микротрубочками. В то же время кинезин-подобный белковый мотор CENP-E находится в кинетохоре, а хромокинезины только на плечах хромосом.

В митозе белковые моторы выполняют несколько основных функций. Одни из них, например динеин, связываются со структурами, включая кинетохоры и плазматическую мембрану, и транспортируют их вдоль микротрубочки (хотя в случае плазматической мембраны движется микротрубочка). Другие имеют множественные домены, организованные таким образом, что мотор может связываться сразу с двумя микротрубочками, и скреплять их между собой. В зависимости от структуры моторов микротрубочки в пучке могут обладать той же самой или противоположной полярностью. Если мотор связывается с микротрубочками противоположной полярности, он будет пытаться двигаться (скользить) по ним до тех пор, пока они перекрываются. Примером такого типа моторов является представитель кинезинов Eg5, который может связываться с обоими концами антипараллельных микротрубочек.

Наоборот, если мотор устроен так, что он связан с двумя микротрубочками с одинаковой полярностью, то в результате образуется структура с такой же полярностью, расположенная таким образом, что микротрубочки образуют фигуру, напоминающую звезду. Прочие кинезин-подобные белки не перемещаются по микротрубочкам, а способствуют разборке их плюс-концов. Наглядным примером такого белка является кинезин, связанный с митотической центромерой (МСАК), который находится на центромере каждой хромосомы. В состав веретена входят моторы с перечисленными выше основными свойствами, которые определенным образом расположены относительно друг друга. Эти же моторы генерируют усилия для движения хромосом.

Не всегда ясно, каким образом моторы обеспечивают функционирование веретена . В ряде случаев, например, они располагаются таким образом, что могут мешать друг другу. Однако, независимо от деталей строения веретена, очевидно, что его образования и функционирования необходимы множественные сбалансированные усилия. Эти усилия обеспечиваются моторами, которые расположены на каркасе динамических микротрубочек веретена.

Хромосомы разделяются посредством митотического веретена

Веретено представляет собой симметричную биполярную структуру, состоящую из микротрубочек, расположенных между двумя полюсами. На каждом полюсе находится центросома

Центросомы прикрепляются к веретену за счет взаимодействия своих кинетохоров с

Веретено представляет собой сложную динамическую структуру, которая быстро образуется в начале процесса деления и при его окончании так же быстро разрушается. Веретено необходимо для митоза и служит для выполнения двух отдельных функций: (1) обеспечение разделения реплицированных хромосом по дочерним ядрам при делении ядра (кариокинез) и (2) управление процессом деления цитоплазмы (цитокинез).

Если заблокировать образование веретена (например, обработав клетки различными химическими соединениями), то хромосомы конденсируются, но не движутся, как это обычно происходит в митозе, и процесс деления останавливается. Во многом веретено представляет собой род биологического мотора, который превращает химическую энергию в механическую работу, необходимую для перемещения хромосом и деления клетки. Функции веретена отражаются в его строении. Симметричная структура с двумя полюсами необходима для успешного прохождения митоза.

Действительно, она отражает принцип парности клеточного деления , при котором одна клетка и реплицированная ДНК делятся на две отдельных дочерних клетки.

Веретено можно увидеть с помощью различных методов. Основной структурный элемент веретена - микротрубочки, слишком малы для того, чтобы их можно было видеть с помощью светового микроскопа (т. е. из-за недостаточного разрешения). Поэтому, хотя в клетках высших организмов часто можно наблюдать с помощью обычного светового микроскопа конденсированные хромосомы, веретена при этом не видно. Однако во многих случаях можно сделать вывод о наличии веретена по косвенному признаку, поскольку эта структура вытесняет видимые клеточные органеллы. При этом, как показано на рисунке ниже, пространство, занимаемое веретеном, по сравнению с окружающей цитоплазмой кажется более прозрачным. Хотя вначале исследователи считали, что веретено состоит из волокон, до начала 1950-х гг. это предположение не было подтверждено прямыми наблюдениями.

К этому времени усовершенствования техники поляризационной световой микроскопии позволили увидеть веретено на препаратах клеток. Типичная фотография веретена, полученная с помощью светового микроскопа, представлена на рисунке ниже. Структура приобрела черную окраску из-за взаимодействия поляризованного света с микротрубочками. В течение 1970-х гг. была разработана техника с использованием флуоресцентных зондов, которая позволила наблюдать компоненты веретена в трехмерном пространстве даже в живой клетке. Эта техника позволяет прослеживать положения одного или нескольких специфических белков веретена в ходе митоза. Одним из таких белков почти всегда является тубулин, поскольку он обеспечивает визуализацию микротрубочек.

При наблюдении в электронном микроскопе веретено типичной клетки млекопитающих состоит из трех структурных компонентов. Как показано на рисунке ниже, в каждом из двух полярных участков находится центросома. Эта красивая органелла включает пару небольших, интенсивно окрашенных структур, называемых центриолями.

Они окружены более или менее плотным диффузным материалом . Между центросомами расположены хромосомы, которые в большинстве клеток являются самыми крупными структурами веретена. Хромосомы состоят из компактных, плотно скрученных и сильно базофильных фибрилл хроматина диаметром 25 нм. Каждая хромосома содержит две небольших структуры, называемых кинетохоры (от греч. kineto - подвижный; chora - пространство). Кинетохоры прикрепляются к противоположным сторонам своей центромеры. Между полюсами веретена проходит плотный пучок расположенных параллельно друг другу микротрубочек.

На рисунке ниже это видно наиболее отчетливо. Один из концов микротрубочек веретена обычно расположен на самом полюсе или рядом с ним. Другой находится в области веретена в свободном состоянии или связан с кинетохором. Микротрубочки растут от каждого полюса, что делает веретено симметричной структурой, образованной двумя параллельными и перекрывающимися пучками микротрубочек. Каждый из этих пучков называется полуверетено. У большинства позвоночных полуверетено состоит из 600-750 микротрубочек, 30-40% которых заканчиваются на кинетохорах.

В каждом полуверетене , наряду с основными микротрубочками, из каждого полюса выходят другие микротрубочки. Эти микротрубочки распространяются во всех направлениях, образуя радиальные структуры, которые называются звездами (астерами) и располагаются в центре каждого полюса. Так же как и микротрубочки веретена, все астральные микротрубочки одним концом ориентированы на полюс, а другим на отдаленную точку в цитоплазме. В митозе астральные звезды обладают несколькими функциями. Наряду с позиционированием веретена в клетке, которое определяет плоскость цитокинеза, они также участвуют в отделении полюсов (центросом) при образовании веретена в анафазе В.

Критическую роль в митозе также играют два кинетохора каждой хромосомы. Их роль в перемещении хромосом обнаружилась очень давно, поскольку оказалось, что фрагменты хромосом, не содержащие кинетохора, не способны к направленному движению. Особенно важно, каким образом располагаются кинетохоры по отношению друг к другу. Поскольку они расположены на противоположных сторонах центромеры, то обращены к противоположным полюсам веретена, что позволяет реплицированным хромосомам присоединяться к обоим полюсам. Наличие такой позиционной взаимосвязи между двумя кинетохорами существенно для сегрегации двух хроматид в разные ядра. При образовании веретена каждый кинетохор связывается с концами множества микротрубочек, исходящих из одного полюса, и образует пучок, называемый кинетохорным пучком, который проходит между кинетохором и полюсом.

И сами кинетохоры не являются всего лишь транспортной системой канатов, позволяющих хроматидам продвигаться к полюсам. Скорее всего, они играют более важную активную роль, не только определяя направление движения хромосомы, но и генерируя усилия, необходимые для этого движения.

Для того чтобы понять молекулярные механизмы митоза , необходимо ответить на следующие кардинальные вопросы. Каким образом формируется веретено и как обеспечивается его биполярная структура? Каким образом генерируются усилия, обеспечивающие движение хромосом и как это движение регулируется? Как обеспечивается точность процесса сегрегации хромосом? Каким образом после сегрегации хромосом происходит разделение цитоплазмы с образованием двух дочерних клеток?

2n-->S-->4n-->2x2n

ПРОФАЗА.
В профазе происходят следующие события: конденсация хромосом, формирование веретена деления, распад ядрышек, эндоплазматического ретикулума (ЭР), цитоплазматических микротрубочек, снижается и прекращается синтез РНК.
Каждая хромосома двойная (2x2n), они тесно соприкасаются и спирализуются одна относительно другой.
Конденсация хроматина.
После S-фазы сестринские хроматиды остаются связаны мультибелковым комплексом когезинов располагающимся вдоль хроматид в процессе их удвоения. Когезины удерживают хроматиды вместе вплоть до их расхождения в анафазе.
Первый признак Митоза – конденсация хромосом (у человека в 50 раз). Конденсины – белки участвующие в конденсации. Запуск M-Cdk фосфорилирования конденсинов отвечает за их сборку в комплексы на ДНК и конденсации хромосом. При конденсации затрачивается энергия АТФ. Хромосомы конденсируются вокруг продольной центральной оси хромосомы на которой наблюдается наибольшая концентрация конденсинов. В фиксированных препаратах наблюдается сначала спиральная укладка конденсинов вдоль хромосомы (рис.1)

рис.1 Спиральная укладка хроматид - окраска на специфические белки показывает их спиральное расположение в хромосомах.

Конденсины и когезины структурно родственны и работают по одинаковым механизмам. Установлено, что если после S-фазы соединение хроматид не наступило правильно, то конденсация также не наступает.
Конденсины (когезины) образуют димеры антипараллельно направленные на концах которых находятся ДНК- и АТФ-связывающие домены, а на середине гибкий шарнир (рис.2).

Когезины связывают хромосомы еще в S-фазе.
Cohesin is a four-subunit protein complex, in which a heterodimer of SMC proteins, in this case SMC1/SMC3, associates with two other proteins, the Scc1/RAD21/Mcd1 and Scc3 proteins. In vertebrates there are two variants of Scc3, called SA1 and SA2.(Jessberger 2005)
SMC (The structural maintenance of chromosomes proteins) обнаружены в бактериях и археях. В отличии от эукариотических, представляют гомодимеры, кодируемые одним геном.

рис.3 Structure of cohesin and a possible mechanism by which it might hold sister chromatids together. (A) Smc1 (red) and Smc3 (blue) form intramolecular antiparallel coiled coils, which are organized by hinge or junction domains (triangles). Smc1/3 heterodimers are formed through heterotypic interactions between the Smc1 and Smc3 junction domains. The COOH terminus of Scc1 (green) binds to Smc1"s ABC-like ATPase head, whereas its NH2 terminus binds to Smc3"s head, creating a closed ring. Scc3 (yellow) binds to Scc1"s COOH-terminal half and does not make any direct stable contact with the Smc1/3 heterodimer. Scc1"s separase cleavage sites are marked by arrows. Cleavage at either site is sufficient to destroy cohesion. By analogy with bacterial SMC proteins, it is expected that ATP binds both the Smc1 and Smc3 heads, alters their conformation, and possibly brings them into close proximity. By altering Scc1"s association with Smc heads, ATP binding and/or hydrolysis could have a role in opening and/or closing cohesin"s ring. (B) Cohesin could hold sister DNA molecules together by trapping them both within the same ring. Cleavage of Scc1 by separase would open the ring, destroy coentrapment of sister DNAs, and cause dissociation of cohesin from chromatin. (C) Smc-containing complexes other than cohesin could also function via chromatid entrapment. Condensin, for example (black), could organize mitotic chromosomes by trapping supercoils. It and/or other related complexes could hold distant loci together (arrow) and thereby facilitate the function of long-range enhancers and silencers of transcription.

Образование веретена деления
В микротрубочках веретена ~10^8 молекул тубулина. Веретено нормально функционирует при разрушении центриолей лазером. Центром организации микротрубочек служит аморфное вещество центросомы.
Микротрубочки растут от центросом, белки диненины связывают перекрывающиеся микротрубочки, которые продолжают расти и расталкиваются кинезинами, при этом полюса расходятся. В это время микротрубочки с кинетохором не связываются.
Число микротрубочек прикрепленных к кинетохорам различно у разных видов – у некоторых грибов – 1микротрубочка, у человека - 20-40.
Остаточное тельце – фрагменты полюсных микротрубочек+плотный матрикс.
После начала митоза центросомы расходятся и каждая образует радиально симметричный центр организации микротрубочек (астра). Центросома расположена у ядра. Две астры двигаются к противоположным сторонам ядра для формирования двух полюсов веретена деления. Когда ядерная оболочка разрушается (прометафаза) веретено захватывает хромосомы. В клетках эмбрионов Xenopus центросома удваивается даже если ядро было передвинуто, или репликация ДНК подавлена. Центросомный цикл продолжается почти нормально: сначала 2, потом 4, 8 центросом и т.д. На ооцитах Xenopus было показано, что G1/S-Cdk (комплекс cyclin E и Cdk2) инициирует ДНК репликацию в S фазе также стимулирует удвоение центросомы, это предположительно объясняет почему удвоение центросом происходит в начале S-фазы
Рост веретена зависит от моторных белков принадлежащих к двум семействам – kinesin-related proteins движущиеся к ‘+’
концу и денеины, движущиеся к ‘–‘. Три типа микротрубочек наблюдаются в веретене – астральные, кинетохорные, перекрывающиеся-создают правильную структуру веретена. Микротрубочки растут от центросомы вперед ‘+’ концом. Три вида микротрубочек различаются поведением и наборами присоед белков.
Веретено начинает собираться в профазе. M-Cdk запускают фосфорилирование двух типов белков контролирующих динамику микротрубочек. Типы: моторные белки и microtubule-associated proteins (MAPs). Также имеются белки катастрофины.
В интерфазе микротрубочки отходят от одной центросомы и находятся в динамическом равновесии. Переключение ведущее к росту называется спасение, переключение к уменьшению микротрубочек – катастрофа. В профазе длинные интерфазные микротрубочки быстро преобразуются в множество коротких окружающих каждую центросому, которые начинают формировать веретено деления.

РАСПАД ЭР
ЭР распадается на мелкие вакуоли, лежащие по переферии клетки и Аппарата Гольджи (АГ), который теряет околоядерную локализацию, разделяется на отдельные диктиосомы разбросанные в цитоплазме.

ПРОМЕТАФАЗА
Распад ядерной оболочки, беспорядочное движение хромосом в области бывшего ядра, хромосомы через кинетохор соединяются с веретеном и начинают движение.

Распад ядерной оболочки

Кинетохор
Sc: кинетохор связан с цетромерным локусом CEN: CDEI,II,III. CDEI,III – консервативные районы сходны с Dm. CDEII – обогащен АТ, участок разной длины. CDE ответственен за связь с мт, взаимодействует с рядом белков.
кинетохор – мультибелковый комплекс, состоит из трех слоев:
наружный – плотный (СENP-E, СENP-F – участвуют в связывании мт), от него отходит множество фибрилл – фиброзная корона кинетохора (СENP-E, динеины)
средний – рыхлый, 3F3/2 – белок, регистрирует натяжение пучков мт
внутренний – плотный, участок ГХ обогащенный а-сателлитной ДНК (СENP-B- связывается с а-ДНК, MCAK-кинезинподобный белок-когезин, INCENP-когезин, СENP-А-аналог H3, СENP-G-связывается с белками ядерного матрикса, СENP-С-ф-ция не выяснена)
Функция кинетохора: связывание хроматид, закрепление мт веретена.
min число мт у Sc 1 на хромосому, у высших растений 20-40 мт на хромосому
белки кинетохора присутствуют во всех стадиях кц, образование и деление кх происх в S-периоде
Х-мы беспорядочно движутся – метакинез – то приближаются к полюсам, то удаляются к центру веретена, пока не займкт среднее положение – конгрессия х-м. мт случайно захватываются кинетохором и х-мы скользят по мт к полюсу 25мкм/мин, с помощью аналога динеина. Во время движения мт не разбираются. Хроматиды связаны и тянутся с двух сторон. Если лазером перерезать мт с одной стороны, то х-мы утянуться к противоположному полюсу
Перемещение хромосом к экватору
если митотич кл обработать D2O или таксолом – подавляют разборку мт?мт удлиняются и не тянут хромосомы?блок митоз
колхицин, низкая t, высокое гидростатич давление – разрушение нитей веретена?блок митоз
сила действующая на кинетохорную нить тем слабее чем ближе к полюсу нах кинетохор

МЕТАФАЗА
Завершается формирование веретена деления, хромосомы перестают двигаться и выстраиваются по экватору веретена (экваториальная пластинка)
метафаза - синтез белка – 20-30% от интерфазы. Клетки наиболее чувствительны к холоду, колхицину и др. агентам, которые разрушают веретено деления и приводят к прекращению митоза (К-митоз), при малых дозах митоз восстанавливается через несколько часов (иначе гибель либо полиплоидия).
Метафаза – хромосомы образуют пластинку, микротрубочки достигают max концентрации и перекрываются.

АНАФАЗА
Анафаза – хромосомы внезапно одновременно отделяются друг от друга и начинают движение к полюсам. Центромеры разъединяются – деградация центромерных когезинов. Наиболее короткая стадия, разделение хроматид и расхождение хромосом к полюсам (v=0,2-5 мкм/мин). Иногда также расходятся полюса друг от друга.
Расхождение хромосом за счет кинетохорных пучков микротрубочек – анафаза А, расхождение хромосом вместе с полюсами за счет удлинения межполюсных микротрубочек – анафаза В.
Разделение хроматид и движение к полюсам.
Веретено и перетяжка связаны так, что пока хромосомы не разойдутся перетяжка цитоплазмы не наступает.
События анафазы: движение кинетохорных нитей к полюсам, движение полюсных нитей расталкивающих полюсы-движутся друг относительно друга; малые дозы хлоралгидрата предотвращают удлинение и движение полюсных нитей, но не влияют на кинетохорную нить.

ТЕЛОФАЗА.
Телофаза длится с момента прекращения движения хромосом. Происходит реконструкция ядер - образование ядерной оболочки, деспирализация хромосом, активация хромосом - увеличение уровня транскрипции, формирование ядрышек, разрушение веретена деления, разделение клеток, образование остаточного тельца Флеминга, образование перетяжки.
В местах контактов хромосом с мембранными пузырьками начинает образовываться ядерная оболочка. Сначала она образуется на латеральных поверхностях хромосом, затем в центромерных и теломерных участках. После смыкания ядерной оболочки происходит образование ядрышек.
Разборка микротрубочек идет от полюсов к экватору бывшей клетки, в средней части веретена микротрубочки сохраняются дольше всего – остаточное тельце.
Цитокинез.
Борозда деления образуется в плоскости метафазной пластинки под прямым углом к длинной оси митотического веретена. Перетяжка содержит актиновые филаменты и миозин II, расположенные по экватору делящейся клетки под плазматической мембраной (ПМ) стягивая ее изнутри.
Одной из причин почему цитокинез не происходит раньше окончания митоза является активность M-Cdk инактивируемой в конце митоза.